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非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒說明書（B 盒） 

【獸藥名稱】 通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒（B 盒） 

漢語拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe（B He） 

英文名稱：African Swine Fever Virus Real-time RCR Detection Kit 商品名稱：無 

【主要成分與含量】 

                       組成                       組份                    規(guī)格 

                                               熒光 PCR 反應(yīng)液          1000µL/管×1 管

                                               Taq 酶                   30µL /管×1 管                                                 B 盒                   陰性對照                1000µL/管×1 管

                                               陽性對照                 1000µL /管×1 管

                                       說明書                   1 份/盒

【作用與用途】用于血液、血球粉、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。 

【用法與判定】 1 用法 1.1 樣品處理 血液樣品直接用；淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研 缽中充分研磨，再加 10.0mL PBS（pH7.2，含 1 萬單位青霉素和 1 萬單位鏈霉素）混勻（樣品不足 2.0g 按 1:5 比例加 PBS），對處理的待檢樣品置 70℃，30 分鐘滅活后，3000r/min，4℃離心 5 分鐘， 取上清液，編號備用；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟。 1.2 樣品存放 采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24h；若需長期保存，須放置-80℃冰箱， 但應(yīng)避免反復凍融（凍融不超過 3 次）。 1.3 操作步驟 1.3.1 病毒 DNA 的提取 病毒 DNA 的提取推薦使用本公司生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒(A 盒)，操作步驟 參照說明書。如客戶自備提取試劑，請參考相應(yīng)提取試劑的使用說明書進行操作。提取好的 DNA 須在 2h 內(nèi)進行 PCR 擴增，若需長期保存須放置 -80℃冰箱，但應(yīng)避免反復凍融。 1.3.2 熒光 PCR 擴增 （1）從試劑盒取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，室溫融化后，2000r/min 離心 5 秒。設(shè)所需 PCR 管數(shù)為 n（n=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要 20µL 熒光 PCR 反應(yīng)液 和 0.5µl Taq 酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當體積小管中，充分混合均勻后，向每個 PCR 管中各分裝 20µL。 （2）分別向上述 PCR 管中加入 1.3.1 中制備的 DNA 溶液各 5µL，蓋緊管蓋，500r/min 離心 30 秒。（3）將加樣后的 PCR 管放入熒光 PCR 檢測儀內(nèi)，作好標記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置： 第一階段，預(yù)變性 95℃/3 分鐘 第二階段，95℃/15 秒，60℃/35 秒共 45 個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的 60℃延伸 時進行。 2 判定2.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定 閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點 為準。對于多通道熒光 PCR 儀，選定 FAM（465-510）檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI 儀器選擇 FAM 獸用無熒光淬滅基團。 2.2 質(zhì)控標準 2.2.1 陰性對照無 Ct 值并且無擴增曲線。 2.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)小于等于 28，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。 2.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。 2.3 結(jié)果判定 2.3.1 陰性：無 Ct 值，且無特征性擴增曲線，表明樣品為陰性。 2.3.2 陽性：Ct 值≤38.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣本為陽性。 2.3.3 Ct 值大于 38.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品建議復驗。復驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為 陽性，否則判為陰性。 

【注意事項】 1 實驗室應(yīng)至少分為三個區(qū)：樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測區(qū)。 2 各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染。檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺進行清潔。 3 Buffer A 有很強的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣服上，否則應(yīng)立即用大量清水沖洗并擦干。 4 在整個檢測過程中應(yīng)注意避免交叉污染：提取核酸時應(yīng)用滅菌的鑷子夾取離心管；對離心管 開蓋時應(yīng)避免粘在手上或濺出，否則要立即更換手套。 5 反應(yīng)液在使用前要*融化，并將反應(yīng)液與 Taq 酶瞬時離心將液體甩至管底。分裝反應(yīng)液時， 應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。 6 陽性對照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩 1~2 秒。 7 試劑盒中各組分應(yīng)避免反復凍融。 8 對樣品及其廢棄物的操作應(yīng)嚴格遵守生物安全規(guī)定。 9 本試劑盒僅供獸醫(yī)及相關(guān)專業(yè)人士使用。

【貯藏與有效期】非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒（B 盒）在-20℃保存，有效期為 12 個月。 

【規(guī)格】48 檢測/盒。 

【批準文號】獸藥生字 191478858 

僅供獸醫(yī)診斷使用